Laboratuvarda sitoloji örneklerinin işlenmesi

Sitolojik örneklerin işlenmesi süreci; spesimen ve istek formunun kabulünü, mikroskopik inceleme için lamların hazırlanmasını, boyanmasını, taranmasını ve raporlanmasını kapsar.  Tüm bu süreçlerde, kalite kontrol ve kalite güvence önlemlerinin uygulanması çok önemlidir.

 

Örnekler ve istek formlarının kabulü

  • Örnek ve istek formu karşılaştırılarak kontrol edilir
  • Örnek üzerinde ve formda hastayı tanımlayıcı en az üç tane bilgi bulunmalıdır (adı, soyadı, doğum tarihi, sağlık sigorta numarası, hastane numarası).
  • Laboratuvarın referans numarası verilir
  • Hasta kimlik ve örnek referans numarası laboratuvarın bilgi yönetim sistemine kaydedilir (LBYS).

 

Mikroskopik inceleme için lamların hazırlanması

  • Sıvı bazlı lamlar, cihazın ve üreticinin talimatlarına uyularak hazırlanır. En sık kullanılan yöntemler, ThinPrep (Hologic) ile SurePath’dir ve hangisi kullanılacaksa laboratuvar içinde el kitabı bulunmalıdır. ThinPrep ekipmanları ve örnekleme metodlarının ilgili linkleri, ana web sitesinde verilmektedir: http://www.thinprep.com/hcp/ifu/
  • BD SurePath için link adresi: http://www1.bd.com/anz/training/surepath

 

Papanicolaou yöntemi kullanılarak boyama

  • Otomatik boyama makinelerinde kullanılan ‘regresiv’ Papanicolaou yöntemi, Tablo 8’de gösterilmiştir 
  • Tüm slaytlar monte, lamelle kaplı ve etiketlidir
  • Her bir hücre çekirdeğinin boyanma ve zıt boyanma özellikleri günlük kontrol edilir.

 

Papanicolaou boyama yöntemi

Dr.Papanicolaou, yılların deneyimlerinden sonra bir Trikrom boyası geliştirdi ve bu boya (biraz değiştirilmiş hali ile) günümüzde halen kullanılmaktadır. Trikrom boyası; bir nükleer boya ile hematoksilen ve iki zıt  boyanın (OG-6 ve EA-50) bir birleşimidir. OG-6 keratini boyarken; EA-50 (eosin ve azure’dan oluşan çiftli boya) skuamöz epitel hücrelerinin sitoplazmasını, nükleolü ve kırmızı kan hücrelerini boyar.

Optimal boyama için; lamdaki  hücrelerin üzerinde istenmeyen kuruma artefaktlarının oluşmaması için, fiksasyondan önce ya da işlem sırasında hücrelerin kurumasına izin verilmemelidir. Her laboratuar kendi renk dengesini sağlamak için, boya modifikasyonlarını sıklıkla yapar: uyarlamalar sıklıkla hematoksilen ve EA-50 boyalarının boyama sürelerini değiştirerek yapılır.

Musluk suyunun kimyasal içeriği, ortam sıcaklığı, örneğin pH’ı ve her seferinde boyanan lamlar sayısı gibi basit varyasyonlar; boyanın renk dengesini etkileyebilir. Sitolojik tanılarda tutarlılığı kolaylaştırmak için, kalite kontrol yöntemleri ile boyama dengesinin tutarlılığını sağlamak laboratuvarların görevidir. Nükleer detayın net bir şekilde tanımlanması ve sitoplazma berraklığının korunması şartıyla, renk dengesinde laboratuvarlar arası değişkenlikler kabul edilebilir.

 

İleriye doğru(progresiv) veya geriye doğru(regresiv) boyama

Progresiv (ileriye doğru) boyama yönteminde; çekirdek haematoksilen ile istenen yoğunlukta boyandıktan sonra nükleer boyamanın yoğunluğu, bir "mavileştirici (blueing)" madde içine lam daldırılarak kontrol edilir. En sık kullanılan ‘blueing’ maddesi, Scott'ın musluk suyudur (pH 8.02). İleriye doğru boyama, sitoplazmayı  çok hafif renklendiriyor.

Geriye doğru (regresiv)  boyama yöntemi kullanılırken; çekirdekler bilinçli olarak, asidik olmayan hematoksilenle fazla boyanırlar. Fazla boya, seyreltik hidroklorik asit çözeltisi ile uzaklaştırılır (asitli su). Soldurma işlemi daha sonra, akan musluk suyuna lamların batırılmasıyla durdurulur. Soldurma(de-staining) işlemi, hiperkromatik bir çekirdeğin  hipokrom hale dönmesine  yol açabileceğinden, geriye doğru  yöntemde zamanlamanın kritik önemi vardır.

Papanicolaou boyasında, değişkenlik faktörleri olarak; kullanılan boyama yöntemi yanısıra boyaların  ticari markası ve hücresel örneğin pH’ını da hatırlatmak isteriz. Sonuç olarak; Papanicolaou boyası tam bir ‘stoikiyometrik’ boya olarak kabul edilemez.

Her iki yöntem de çalışır ve laboratuvara bağlı  olarak bu yöntemlerden herhangi biri  kullanılabilir. Genel boyama sonuçları ve tanısal kapasiteleri benzerdir. 

Papanicolaou boyamasının özellikleri

Her bir çekirdek;

  • Küçük büyütmede (x10’luk objektif) ve büyük büyütmede net görülebilir (x40’lık objektif)
  • Mor/mavi ya da siyah renkte izlenir
  • Granüler ve keskin sınırlı (puslu değil)

Zıt boyalar (sitoplazma)

  • Yüzeyel skuamöz hücreler -pembe
  • Daha az olgun hücreler(intermedyer ve metaplastic hücreler)  - mavi/yeşil
  • Tümüyle keratinize hücreler -turuncu.

Boyaların yoğunlukları eşit olmalıdır

Nükleer boyanma ile keskin bir kontrasta sahip bir sitoplazmik saydamlık olmalıdır

Figure 8.8. Ideal Papanicolaou staining

Tablo 8.1. Regresif Papanicolaou boyama yöntemi (Otomatik boyama makinesi için)

İstasyon

Solüsyon

Zaman (dakika)

1

%95 alkol

1:30

2

%70 alkol

1:30

3

Hematoksilen

4:00

4

Asit su

0:05

Yıkama 1

Su

Yıkama

Yıkama 2

Su

Yıkama

Yıkama 3

Su

Yıkama

Yıkama 4

Su

Yıkama

5

%70 alkol

2:00

6

%95 alkol

1:00

7

OG6

2:00

8

%95 alkol

0:10

9

%95 alkol

0:10

10

EA50

6:00

11

%95 alkol

0:15

12

%95 alkol

0:15

13

Absolü alkol

1:00

14

Absolü alkol

1:00

15

Absolü alkol

1:00

16

Ksilen

3:00

17

Ksilen

2:00

Çıkış

Ksilen

1:00

 

Tarama ve sitolojinin raporlanması

  • Bir sitoteknolog veya sitoloji tarayıcısı lamları tarar.
  • Kurumsal protokollere bağlı olarak; negatif ya da yetersiz olarak değerlendirilen tüm lamlar, hızla yeniden gözden geçirilir (rapid review) ve herhangi bir anormallik gözlendiğinde, daha kıdemli bir sitoteknoloğa değerlendirmesi için yönlendirilir.
  • Negatif ve yetersiz sonuçlar, kurumsal protokollere göre tarayıcılar tarafından imzalanır,
  • Tüm anormal sitoloji lamları ise kurumsal protokollere de bağlı kalınarak, nihai rapor için bir danışman patoloğa, kıdemli bir  bilim insanına ya da bir biyomedikal uzmanına yönlendirilir.
  • Nihai rapor; imzalanır, kaydedilir ve posta yolu ile veya elektronik olarak yaymayı alan kişiye gönderilir.
  • Nihai rapor; hastanın yönetimi için öneriler içerir, bunlar kolposkopik muayene önerilmesi veya örnek yetersiz ise yayma testinin tekrarı olabilir.
  • Eğer önerilmişse, ASC-US ile düşük dereceli epitelyal hücre anormalliğinin triyajında veya CIN tedavisi sonrasında kür testi olarak HPV testi yapılır.
  • Hasta, testinin sonucu hakkında bilgilendirilir.
  • Klinisyen veya örneği alan klinik, anormal sitolojik sonuç durumunda gerekli adımları atmakla sorumludur.
  • Kolposkopi randevuları ve tekrar testleri için bir hatırlatma sistemi kurulmalıdır.

Bu prosedürler; laboratuvarlar, bölgeler ve ülkeler arasında değişkenlik gösterebilir, ancak servikal kanser taramasının kalite güvencesi hakkındaki Avrupa kılavuzlarına uyulmalıdır (Wiener ve ark.).

Konvansiyonel ve sıvı bazlı sitoloji ile tarama protokolleri

Kalite kontrol yöntemlerini de içeren tarama ve raporlama protokolleri; bölümdeki danışman patologlarla işbirliği içinde laboratuvar yöneticisi tarafından uygulanmalıdır.

Deneyimlerini geliştirmek amacıyla, sitoteknologlar geniş bir yelpazede lam çeşitliliği olan olguları görmelidir. Laboratuvarlar yılda en az 15.000 servikal yaymayı değerlendirmelidir ve her bir tarayıcının, düzenli molalar ile birlikte, günde 50 konvansiyonel veya 80 SBS yaymayı taraması beklenebilir. Tarayıcının kendi çalışma alanı ile binoküler mikroskopu bulunmalı ve yılda en az 3000 olguyu taraması hedeflenmelidir.

Hazırlanan slaytlar, x10’luk objektif ve x10’luk oküler kullanılarak anormal hücreler açısından taranmalıdır; tüm slaytı taramak için de aynı objektif  kullanılmalıdır. Tarayıcı, lamel altındaki tüm alanı detaylı bir şekilde incelemelidir. Taramaya genellikle lamın en köşesine gelinerek başlanılır ve adım adım lam ilerletilerek, lamelin kapladığı tüm alan tamamlanana kadar devam edilir.

Şekil 8.10 Konvansiyonel bir yaymanın taraması

Bir tarayıcının; x10’luk bir objektif kullanarak, bir lamı tarama işlemi sırasında yaklaşık 250-300 görme alanını incelediği tahmin edilmektedir. Konvansiyonel sitolojide bu süreci tamamlamanın ortalama süresi 6-10 dakikadır (aralığı 5 -20 dakika)

Tarayıcının görevi, servikal yaymadaki ilgili hücreleri işaretlemektir. İşaretler veya noktalarken x 4’lük objektif kullanılmalıdır. İşaretleme protokolleri, laboratuvarlar tarafından kararlaştırılmakla birlikte normalde SBS tarandığında, renkli uçlu keçeli kalem, konvansiyonel yayma işaretlenirken ise beyaz mürekkepli işaretleme kalemi kullanılır. İlgi çekici alanları veya hücreleri detaylı olarak incelerken  x20’lik  veya x40’lık  objektif kullanılmalıdır.

Her bir yaymada sitoloji talep formu bulunmalı ve kadının servikal tarama öyküsü yaymayı incelemesinden önce sitolog tarafından gözden geçirilmelidir.

ThinPrep lamını tarama protokolleri

  • Konvansiyonel yaymadan sıvı bazlı sitolojiye dönüşüm sürecinde sitologlar, laboratuvarlarında kullanılan teknolojiye (ThinPrep/ Surepath) yönelik eğitim almalıdır. 
  • ThinPrep; konvansiyonel yaymanın fiksatifi olan etanol-bazlıdan farklı olan metanol-bazlı fiksatif kullanmaktadır. ThinPrep lamlarında nükleer detay iyi korunmuştur; ancak nükleer membranın daha belirgin olması, immatür skuamöz metaplazi ile HSIL arasındaki ayırıcı tanıda daha dikkatli olmayı gerektirir. ThinPrep lamları, tarayıcının tercihine bağlı olarak, yatay ya da yukarıdan aşağıya düşey düzlemde yapılabilir.
  • Hızlı inceleme (rapid review) veya ön inceleme (pre-view) ile ilgili bir kılavuz henüz bulunmamaktadır.

SurePath lamını tarama protokolleri

  • Konvansiyonel yaymadan sıvı bazlı sitolojiye dönüşüm sürecinde sitologlar, laboratuvarlarında kullanılan teknolojiye (ThinPrep/ Surepath) yönelik eğitim almalıdır. 
  • SurePath’de kullanılan fiksatif, konvansiyonel yayma için kullanılan etanol-bazlı fiksatifle aynıdır. 
  • SurePath’in lamlarında taranacak hücre alanı Thin-Prep’e göre daha küçük çaplı olmasına rağmen, lamın taranması için geçen süre daha kısa olmamaktadır çünkü SurePath preparatları, tek tabaka halinde dağılmazlar ve üç boyutlu hücre gruplarına büyük büyütmede, yukarı aşağı taramalarla odaklanılması gerekmektedir

Sıvı bazlı sitoloji için eğitim

  • Sitologlar ve patologlar için, konvansiyonel yaymalardan sıvı-bazlı sitolojiye geçiş sürecinde, laboratuvarlarında kullanılan teknolojiye (ThinPrep/ Surepath) yönelik özel mikroskobik eğitim alınması gereklidir.
  • SurePath ve ThinPrep arasındaki benzerlikler, farklılıklarından daha çok olmasına rağmen her biri için ayrı eğitim alınması gerekmektedir.

 

X