Processare i campioni citologici in laboratorio

Il processamento dei campioni citologici in laboratorio coinvolge il ricevimento del campione con la richiesta, la preparazione del vetrino per l’esame microscopico, la colorazione, lo screening e la refertazione. Tutti questi processi sono soggetti al controllo di qualità e a misure di garanzia di qualità.

 

Ricevimento del campione e della richiesta

  • I dettagli sul campione e sulla richiesta sono controllati perchè combacino.
  • Campione  e richiesta devono avere almeno tre identificativi del paziente (nome, cognome, data di nascita, numero NHS e numero di riferimento dell’ospedale).
  • Viene assegnato il numero del laboratorio.
  • I dettagli del paziente e il numero di laboratorio vengono registrati sul sistema informatico (LIMS).

 

Preparazione dei vetrini per l’esame microscopico

  • I vetrini per la citologia su strato liquido sono preparati usando gli strumenti e le istruzioni del produttore. I metodi più usati sono ThinPrep (Hologic) e SurePath, i cui manuali dovrebbero essere tenuti in laboratorio e usati.
  • Links per tutti gli strumenti e metodi per la raccolta dei campioni per ThinPrep si trovano sul sito principale: http://www.thinprep.com/hcp/ifu/
  • Links a BD SurePath http://www1.bd.com/anz/training/surepath

 

Colorazione usando il metodo Papanicolaou

  • Il metodo regressivo Papanicoloau è mostrato nella Tabella 8 come viene effettuato nei coloratori automatici.
  • Tutti i vetrini sono montati con il coprioggetto ed etichettati. 
  • La colorazione dei singoli nuclei e delle controcolorazioni sono controllate ogni giorno.

 

Il metodo di colorazione Papanicolaou

Dopo anni di esperimenti, il dott. Papanicolaou sviluppò una colorazione tricromica che è ancora usata oggi (sebbene leggermente modificata). La colorazione tricromica è la combinazione di una colorazione nucleare, ematossilina, e due controcolorazioni, OG-6 e EA-50. OG-6 colora la cheratina mentre EA-50 (una doppia colorazione, eosina e azzurro) colora il citoplasma delle cellule squamose epiteliali, nucleoli e globuli rossi.

Per una colorazione ottimale, le cellule sul vetrino non si devono asciugare all’aria prima della fissazione o durante il processo poichè si creano artefatti. Modificazioni alla colorazione sono fatte frequentemente perchè ogni laboratorio preferisce il proprio bilancio tra i colori: i cambiamenti si possono fare cambiando la lunghezza dei tempi in ematossilina e EA-50.

Variazioni semplici, come il contenuto chimico dell’acqua corrente, la temperatura dell’ambiente, il pH del campione e il numero di vetrini colorati per slot, può influenzare il bilancio tra i colori della colorazione. E’ dovere dei laboratori, attraverso il controllo di qualità, mantenere una intensità costante della colorazione per facilitare la diagnosi.

Posto che il dettaglio nucleare sia chiaramente definito e la trasparenza del citoplasma venga mantenuta, una variazione inter-laboratorio è accettabile.

 

Colorazione progressive o regressive

Nel metodo progressivo, l’intensità della colorazione nucleare è controllata tramite l’immersione del vetrino in un agente “blu” dopo che il nucleo è stato colorato con l’ematossilina all’intensità richiesta. Il “blu” più frequentemente usato è l’acqua di Scott (pH 8.02). Il metodo progressivo tinge il citoplasma in modo molto leggero.

Quando si usa il metodo regressivo, il nucleo è deliberatamente ultra colorato con una ematossilina non acidificata. L’eccesso di colorazione è rimossa con una soluzione di acido cloridrico diluito (acqua acida). Il processo decolorante è poi fermato immergendo il vetrino nell’acqua corrente. Il tempo è un elemento cruciale del metodo regressivo, poichè la decolorazione può rendere ipocromatico un nucleo ipercromatico.

La colorazione di Papanicolaou non solo dipende dal metodo usato ma anche dal produttore delle colorazioni e dal pH del campione e, di conseguenza, non può essere considerata una colorazione stechiometrica perfetta.

Entrambi questi metodi funzionano bene, e, anche in base al laboratorio, possono essere usati a scelta. I risultati del colore e delle capacità diagnostiche sono sovrapponibili.

 

Caratteristiche della colorazione di Papanicolaou

Nuclei singoli

  • Chiaramente visibili a basso ingrandimento (obiettivo x10) e ad alto ingrandimento (obiettivo x40)
  • Colore da blu/viola a nero
  • Granulare e crespo (non indistinto)

Controcolorazioni (citoplasma)

  • Cellule superficiali squamose - rosa
  • Cellule meno mature (intermedie e metaplastiche)- blu/verde
  • Cellule interamente cheratinizzate- arancio

Le colorazioni dovrebbero essere della stessa intensità.

Dovrebbe essere presente una transulcenza citoplasmatica in netto contrasto con la colorazione nucleare.

 

Figure 8.8. Ideal Papanicolaou staining

 

Tabella 8.1. Metodo regressivo della colorazione di Papanicolaou (Colorazione automatica)

Stazione

Soluzione

Tempo (minuti)

1

95% Alcol

1:30

2

70% Alcol

1:30

3

Ematossilina

4:00

4

Acqua acida

0:05

Lavaggio1

Acqua

Lavaggio

Lavaggio 2

Acqua

Lavaggio

Lavaggio 3

Acqua

Lavaggio

Lavaggio 4

Acqua

Lavaggio

5

70% Alcol

2:00

6

95% Alcol

1:00

7

OG6

2:00

8

95% Alcol

0:10

9

95% Alcol

0:10

10

EA50

6:00

 

Esaminare e refertare la citologia

  • Un citotecnologo o un citologo guarda i vetrini.
  • In base ai protocolli locali, tutti i vetrini negativi o inadeguati sono rivisti rapidamente e quelli anormali sono portati ad un citotecnologo esperto per la valutazione.
  • I negativi o gli inadeguati sono refertati in base ai protocolli locali.
  • Tutti i vetrini con una citologia anormale vengono inviati ad un patologo o ad un citologo per la stesura del referto finale in base ai protocolli locali.
  • Il referto finale è firmato, registrato, inviato via posta o elettronicamente al clinico di riferimento.
  • Il referto finale include un consiglio per il successivo management, come l’esecuzione dell’esame colposcopico o la ripetizione dello striscio se è inadeguato.
  • Il test per HPV è eseguito se richiesto per il triage degli ASC-US/lesioni a basso grado o come test di cura dopo il trattamento per un CIN.
  • Il paziente è informato del risultato del test.
  • Il clinico o l’ambulatorio che ha inviato il test è responsabile che vengano presi i provvedimenti adeguati in caso di risultati anormali a meno di un accordo scritto.
  • Dovrebbe essere in uso un sistema per registrare gli appuntamenti colposcopici e la ripetizione dei test.

Queste procedure possono variare tra laboratori, regioni o stati ma dovrebbero comunque seguire le linee guida europee per il controllo di qualità dello screening cervicale. (Wiener et al.)

 

Protocolli per lo screening della citologia tradizionale e su base liquida

I protocolli di screening e refertazione con le misure integrate per i controlli di qualità dovrebbero essere implementate dal resposabile di laboratorio in collaborazione con i patologi del dipartimento.

Per formarsi adeguatamente, i citotecnici dovrebbero vedere un ampia varietà di casi. I laboratori devono processare almeno 15000 strisci cervicali all’anno e ogni citologo dovrebbe guardarne almeno 50 (per la citologia tradizionale) o 80 ( per LBC) al giorno con pause ad intervalli regolari. Al citologo dovrebbe essere fornita una postazione con un microscopio e dovrebbe raggiungere il traguardo minimo di almeno 3000 casi l’anno.

I preparati dovrebbero essere letti utilizzando obiettivi con ingrandimento a 10x e  oculari a 10x e lo stesso obbiettivo dovrebbe essere usato per la scrinatura di tutto il preparato. L’esaminatore dovrebbe procedere di campo in campo su tutta la sezione finché l’intera area coperta dal coprioggetto non sia stata letta. In genere la partenza è ad un angolo del vetrino e seguendo sempre lo stesso senso di lettura si procede finché non sia studiato tutto il vetrino.

 

Figura 8.10 Come scrinare uno striscio convenzionale

 

E‘ stato valutato che utilizzando obiettivi a basso ingrandimento (10x), un esaminatore guardi dai 250 ai 300 campi durante l'analisi di un singolo preparato. Questo richiede un tempo medio di circa 6-10 minuti (con un range dai 5 ai 20 minuti). L’esaminatore deve poi evidenziare le cellule interessanti e utilizzare un obiettivo da x4. Un protocollo per segnalare le cellule deve essere preso in considerazione nel laboratorio: solitamente vengono utilizzati pennarelli per la LBC e l’inchiostro bianco per la citologia tradizionale. Per studiare aree di particolare interesse vanno utilizzati ingrandimenti da 20x o 40x.

Il foglio di richiesta dell‘esame citologico e la storia clinica o di screening della paziente devono essere presenti e valutati prima di esaminare il vetro. 

 

Protocolli per lo studio di un vetrino ThinPrep

  • La formazione per la citologia su base liquida dovrebbe essere disponibile per tutti i citotecnici che arrivano dalla citologia tradizionale.
  • Il fissativo usato per il ThinPrep è a base di metanolo, che è diverso da quello a base di etanolo degli strisci tradizionali. I dettagli nucleari sono ben preservati ma anche la membrana nucleare è ben visibile e questo potrebbe rendere difficoltosa la distinzione tra cellule metaplastiche immature e HSIL.
  • Il vetrino ThinPrep può essere letto sia da un lato all’altro che dal basso verso l’alto.
  • Non ci sono line guida per una rapida revisione o una pre-valutazione.

 

Protocolli per lo studio di un vetrino SurePath

  • La formazione per la citologia su base liquida dovrebbe essere disponibile per tutti i citotecnici che arrivano dalla citologia tradizionale
  • Il fissativo usato per il SurePath è a base di etanolo, simile a quello per la citologia tradizionale.
  • Sebbene l’area da studiare in un vetrino SurePath è ridotta rispetto a quella del ThinPrep, si deve usare lo stesso tempo per leggerlo. I preparati SurePath non sono monostrato e i gruppi di cellule tridimensionali devono essere guardati ad alto ingrandimento e su tutti i piani.
  • Chi usa abitualmente SurePath consiglia di guardare rapidamente il vetrino e poi lentamente i gruppi tridimensionali di cellule. (comunicazione personale N. Dudding)
  • Non ci sono line guida per una rapida revisione o una pre-valutazione.

 

Addestramento per la citologia su base liquida

  • I citotecnici e i patologi che passano dalla citologia tradizionale a quella su base liquida hanno bisogno un addestramento dedicato.
  • Sebbene ci siano più somiglianze che differenze tra SurePath e ThinPrep, è necessario fare un addestramento specifico per ognuno di loro.

 

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