Παραπέμποντας κυτταρολογικά δείγματα στο εργαστήριο

Η παραπομπή κυτταρολογικών δειγμάτων εμπεριέχει την παραλαβή του υλικού και του παραπεμπτικού, προετοιμασία των πλακιδίων για μικροσκοπική εξέταση, χρώση, μικροσκόπηση και γνωμάτευση των πλακιδίων. Όλα αυτά τα βήματα υπόκεινται σε έλεγχο της ποιότητας και σε μέτρα διασφάλισης της ποιότητας.

 

Παραλαβή του υλικού και του παραπεμπτικού

  • Λεπτομέρειες στο υλικό και στη φόρμα του παραπεμπτικού ελέγχονται ώστε να βεβαιωθεί ότι ταιριάζουν
  • Υλικό και παραπεμπτικό πρέπει να έχουν τουλάχιστον τρία στοιχεία ταυτότητας (όνομα, επώνυμο, ημερομηνία γέννησης, Αριθμός Συστήματος Υγείας, Αριθμός Νοσοκομείου).
  • Καθορισμός του αριθμού του εργαστηρίου.
  • Τα στοιχεία ταυτότητας της ασθενούς και αριθμός του δείγματος εισάγονται στο πληροφοριακό σύστημα του εργαστηρίου.

 

Προετοιμασία των πλακιδίων για μικροσκοπική εξέταση

  • Πλακίδια υγρής φάσης επεξεργάζονται με τον συνοδό εξοπλισμό σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι είναι το  ThinPrep (Hologic) και το SurePath, τα εγχειρίδια χρήσης των οποίων πρέπει να υπάρχουν στο εργαστήριο.
  • Σύνδεσμοι με όλο τον εξοπλισμό του ThinPrep και μεθόδους για συλλογή των δειγμάτων παρέχονται στον παρακάτω ιστότοπο: http://www.thinprep.com/hcp/ifu/
  • Σύνδεσμοι με το  BD SurePath http://www1.bd.com/anz/training/surepath

 

Χρώση με τη μέθοδο Παπανικολάου

  • Η ανάδρομη μέθοδος Παπανικολάου καταδεικνύεται στον Πίνακα Table 8.xx  όπως χρησιμοποιείται στα αυτοματοποιημένα μηχανήματα χρώσεων.
  • Όλα τα πλακίδια καλύπτονται με καλυπτρίδα και επισημαίνονται με ταμπέλες.
  • Τα χαρακτηριστικά χρώσεων των πυρήνων και χρωστικών αντιθέσεων ελέγχονται σε καθημερινή βάση

 

Η μέθοδος χρώσης Παπανικολάου

Μετά από χρόνια πειραματικής εργασίας, ο Δρ Παπανικολάου ανέπτυξε μία τρίχρωμη χρώση, που μέχρι σήμερα ακόμη χρησιμοποιείται (αν και ελαφρώς τροποποιημένη). Η τρίχρωμη χρώση είναι ένας συνδυασμός μίας πυρηνικής χρώσης, αιματοξυλίνης και δύο αντιχρώσεων, OG-6 και EA-50.  OG-6 βάφει την κερατίνη ενώ EA-50, (μία διπλή χρώση, εωσίνη και γαλάζιο) βάφει κυτταρόπλασμα των πλακωδών επιθηλιακών κυττάρων, πυρήνια και ερυθροκύτταρα.

Για ικανοποιητική χρώση, τα κύτταρα στο πλακίδιο δεν θα πρέπει να επιτραπεί να στεγνώσουν πριν τη μονιμοποίηση ή κατά την μεταφορά καθόσον αυτό θα οδηγήσει σε μη αποδεκτές «παρενέργειες» (artefacts). Τροποποίηση της χρώσης είναι συχνή για κάθε εργαστήριο που προτιμάει τη δική του χρωματική ισορροπία: ρυθμίσεις μπορεί να γίνουν με αλλαγές στους χρόνους στην αιματοξυλίνη και EA-50.

Άλλες μεταβολές όπως η χημική σύσταση του τρεχούμενου νερού, η θερμοκρασία, το pH του υλικού και ο αριθμός των προς χρώση πλακιδίων, δυνατόν να επιδράσουν στη χρωματική ισορροπία της χρώσης. Είναι καθήκον των εργαστηρίων, μέσω του ελέγχου της ποιότητας, να διατηρούν μία σταθερή ένταση ώστε να διευκολύνουν μία σταθερή κυτταρολογική διάγνωση. Με την προϋπόθεση ότι η πυρηνική λεπτομέρεια καθορίζεται ευκρινώς και η διαφάνεια του κυτταροπλάσματος διατηρείται, ενδο-εργαστηριακές διαφορές στη χρωματική ισορροπία είναι αποδεκτές. 

 

Προοδευτική ή ανάδρομη χρώση

Με την χρήση της προοδευτικής μεθόδου, η ένταση της πυρηνικής χρώσης ελέγχεται με εμβάπτιση του πλακιδίου σε «κυανίζοντα» παράγοντα αφού ο πυρήνας έχει βαφεί με την απαιτούμενη ένταση με αιματοξυλίνη. Ο κυανίζων παράγοντας που χρησιμοποιείται συχνότερα είναι το νερό Scott’s (pH 8.02). Η προοδευτική χρώση βάφει το κυτταρόπλασμα πολύ ελαφρά.

Όταν χρησιμοποιείται η ανάδρομη μέθοδος χρώσης, ο πυρήνας είναι σκόπιμα υπερκεχρωσμένος με μία μη-οξινοποιημένη αιματοξυλίνη. Η υπερβολική χρωστική απομακρύνεται με διάλυμα υδροχλωρικού οξέος (όξινο νερό). Η διαδικασία αποχρωμάτωσης σταματάει με την εμβάπτιση του πλακιδίου σε τρεχούμενο νερό βρύσης. Ο χρόνος είναι βασικός στην ανάδρομη μέθοδο καθόσον η αποχρωμάτωση μπορεί να οδηγήσει από υπερχρωματικό πυρήνα σε υποχρωματικό.

Μία ακόμη παράμετρος στη χρώση Παπανικολάου δεν εξαρτάται μόνον από τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο αλλά επίσης από την εμπορική προέλευση των χρώσεων και το pH του κυτταρικού δείγματος. Κατά συνέπεια η χρώση Παπανικολάου δεν δύναται να θεωρηθεί ότι είναι μία ακριβής στοιχειομετρική χρώση.

Και οι δύο μέθοδοι δουλεύουν τόσο καλά, και εξαρτάται από το εργαστήριο, ποια από τις δύο θα χρησιμοποιήσει. Το συνολικό χρωστικό αποτέλεσμα και η διαγνωστική ικανότητα είναι συγκρίσιμα.

 

Χαρακτηριστικά της χρώσης Παπανικολάου

Μεμονωμένοι πυρήνες

  • Ευκρίνεια σε μικρή (x10) και μεγάλη (x40) μεγέθυνση
  • Μπλε/μωβ μέχρι μαύροι σε χρώμα
  • Κοκκιώδεις και διαυγείς (όχι θολοί)

Αντιχρώσεις (κυτταρόπλασμα)

  • Επιπολής πλακώδη κύτταρα - ροζ
  • Λιγότερο ώριμα κύτταρα (διάμεσα και μεταπλαστικά) – μπλε/πράσινα
  • Πλήρως κερατινοποιημένα κύτταρα  - πορτοκαλί.

Οι χρώσεις θα πρέπει να έχουν ίση ένταση

Θα πρέπει να υπάρχει κυτταροπλασματική διαφάνεια με σαφή αντίθεση στην πυρηνική χρώση

 

Figure 8.8. Ideal Papanicolaou staining

 

Πίνακας 8.1. Ανάδρομη χρώση Παπανικολάου (Αυτοματοποιημένο μηχάνημα χρώσης)

Πλύση 2

Νερό

Πλύση

Πλύση 3

Νερό

Πλύση

Πλύση 4

Νερό

Πλύση

5

70% Αλκοόλη

2:00

6

95% Αλκοόλη

1:00

7

OG6

2:00

8

95% Αλκοόλη

0:10

9

95% Αλκοόλη

0:10

10

EA50

6:00

11

95% Αλκοόλη

0:15

12

95% Αλκοόλη

0:15

13

Απόλυτη Αλκοόλη

1:00

14

Απόλυτη Αλκοόλη

1:00

15

Απόλυτη Αλκοόλη

1:00

16

Ξυλόλη

3:00

17

Ξυλόλη

2:00

Τέλος

Ξυλόλη

1:00

 

Μικροσκόπηση και κυτταρολογική έκθεση

  • Ο ιατρός κυτταρολόγος μικροσκοπεί τις αντικειμενοφόρες πλάκες.
  • Σύμφωνα με τα τοπικά πρωτόκολλα, όλα τα διεκπεραιωμένα πλακίδια ως αρνητικά ή ανεπαρκή υπόκεινται σε ταχεία ανασκόπηση και όταν βρεθούν ανωμαλίες παραπέμπονται στον επικεφαλής κυτταρολόγο για αξιολόγηση.
  • Αρνητικά και ανεπαρκή αποτελέσματα υπογράφονται σύμφωνα με τα τοπικά πρωτόκολλα,
  • Όλα τα παθολογικά κυτταρολογικά πλακίδια παραπέμπονται στον επικεφαλής ιατρό κυτταρολόγο σύμφωνα με τα τοπικά πρωτόκολλα προς έκδοση του τελικού αποτελέσματος.
  • Το τελικό αποτέλεσμα υπογράφεται, καταγράφεται και αποστέλλεται είτε ταχυδρομικώς είτε ηλεκτρονικώς στον λήπτη του δείγματος.
  • Οι τελικές εκθέσεις περιλαμβάνουν σύσταση για διαχείριση, όπως παραπομπή για κολποσκοπική εξέταση ή επανάληψη του τεστ εφόσον το δείγμα είναι ανεπαρκές.
  • Το HPV testing διενεργείται εφόσον χρειάζεται για διαλογή ASC-US/χαμηλόβαθμης αλλοίωσης ή ως τεστ ίασης μετά από θεραπεία CIN.
  • Η ασθενής ενημερώνεται για το αποτέλεσμα του τεστ.
  • Ο παραπέμπων κλινικός ή η κλινική είναι υπεύθυνοι να αναλάβουν κατάλληλη δράση σε περιπτώσεις παθολογικού αποτελέσματος, εκτός εάν υπάρχουν καταγεγραμμένα διαφορετικά πρωτόκολλα, σε σχέση με την παραπομπή για κολποσκόπηση και αιτήματος για επαναλαμβανόμενα τεστ.
  • Θα πρέπει να υπάρχει ένα σύστημα υπενθυμίσεων των ραντεβού για κολποσκόπηση και επαναλαμβανόμενων τεστ. 

Αυτές οι διαδικασίες μπορεί να ποικίλλουν μεταξύ των εργαστηρίων και των χωρών αλλά θα πρέπει να ακολουθούνται οι Ευρωπαϊκές Κατευθυντήριες Οδηγίες για την διασφάλιση της ποιότητας στον έλεγχο του καρκίνου του τραχήλου (Wiener et al.)

 

Πρωτόκολλα για μικροσκόπηση συμβατικής και υγρής φάσης κυτταρολογίας

Πρωτόκολλα μικροσκόπησης και έκδοσης αποτελεσμάτων με παράλληλα μέτρα ελέγχου της ποιότητας θα πρέπει να εφαρμόζονται από τον Υπεύθυνο Ποιότητας του εργαστηρίου σε συνεργασία με τον επικεφαλής ιατρό κυτταρολόγο του τμήματος.

Προκειμένου να υπάρξει εμπειρία, οι κυτταρολόγοι θα πρέπει να μικροσκοπούν ένα ευρύ φάσμα περιπτώσεων. Τα εργαστήρια θα πρέπει να διαθέτουν τουλάχιστον 15,000 τραχηλικά δείγματα ανά έτος και ο κάθε κυτταρολόγος αναμένεται να μικροσκοπεί 50 (συμβατικά) ή 80 (υγρής φάσης / LBC) επιχρίσματα ημερησίως με τακτικά διαλλείματα. Ο κυτταρολόγος θα πρέπει να έχει προσωπικό χώρο εργασίας και διοφθάλμιο μικροσκόπιο και θα πρέπει να μικροσκοπεί τουλάχιστον 3000 περιπτώσεις ετησίως.

Τα προετοιμασμένα πλακίδια θα πρέπει να μικροσκοπούνται για ανώμαλα κύτταρα χρησιμοποιώντας αντικειμενικούς και διοφθάλμιους φακούς μεγέθυνσης x10, με τον ίδιο αντικειμενικό να χρησιμοποιείται για τη μικροσκόπηση όλου του πλακιδίου. Αυτός που μικροσκοπεί θα πρέπει να διατρέχει πεδίο-πεδίο κατά μήκος του πλακιδίου μέχρις ότου μικροσκοπήσει όλη την περιοχή. Είναι ασύνηθες να ξεκινάει η μικροσκόπηση από τη μία γωνία του πλακιδίου και να δουλεύεται σταδιακά μέχρις ότου μικροσκοπηθεί όλη την περιοχή. 

 

Σχήμα 8.10 Μικροσκόπηση ενός συμβατικού επιχρίσματος

 

Έχει εκτιμηθεί ότι αυτός που μικροσκοπεί θα έχει εξετάσει κατά προσέγγιση 250-300 πεδία κατά την διάρκεια της διαδικασίας της μικροσκόπησης ενός πλακιδίου (χρησιμοποιώντας x10 μεγέθυνση). Η ώρα που απαιτείται για να ολοκληρωθεί αυτή η διαδικασία για τη συμβατική κυτταρολογία είναι 6-10 λεπτά (κυμαίνεται από 5 έως 20 λεπτά).

Το καθήκον αυτού που μικροσκοπεί είναι να σημειώσει τα κύτταρα ενδιαφέροντος στο τραχηλικό επίχρισμα. Κατά τη εν λόγω σήμανση θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί x4 μεγέθυνση. Το πρωτόκολλο για τη σήμανση θα πρέπει να αποφασιστεί από το εργαστήριο, ωστόσο έγχρωμοι μαρκαδόροι συνήθως χρησιμοποιούνται όταν μικροσκοπούνται πλακίδια υγρής φάσης και λευκοί μαρκαδόροι όταν σημαίνεται ένα συμβατικό πλακίδιο. Όταν διερευνώνται περιοχές ή κύτταρα με ιδιαίτερο ενδιαφέρον θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν μεγεθύνσεις x20 ή x40.

Το κυτταρολογικό παραπεμπτικό και το ιστορικό ελέγχου του τραχήλου θα πρέπει να υπάρχουν σε κάθε επίχρισμα και θα πρέπει να μελετάται από τον κυτταρολόγο προτού εξετάσει το επίχρισμα.

 

Πρωτόκολλα για μικροσκόπηση ενός πλακιδίου ThinPrep

  • Η εκπαίδευση θα πρέπει να παρέχεται στους κυτταρολόγους με την αλλαγή από συμβατική κυτταρολογία σε κυτταρολογία υγρής φάσης, οποιαδήποτε και αν είναι η τεχνολογία που χρησιμοποιείται.
  • ThinPrep χρησιμοποιεί μονιμοποιητικό βασισμένο σε μεθανόλη, ενώ είναι διαφορετικό από το βασισμένο σε αιθανόλη μονιμοποιητικό του συμβατικού επιχρίσματος.  Η πυρηνική λεπτομέρεια διατηρείται καλά στα πλακίδια ThinPrep αλλά η πυρηνική μεμβράνη είναι περισσότερο διακριτή, το οποίο πιθανόν να έχει επίδραση στη διαγνωστική διάκριση μεταξύ ανώριμης πλακώδους μετάπλασης και HSIL.
  • Μικροσκόπηση πλακιδίων ThinPrep μπορεί να γίνει από άκρη σε άκρη ή άνω και κάτω όπως επιθυμεί ο κυτταρολόγος.
  • Δεν υπάρχουν ειδικές κατευθυντήριες οδηγίες για ταχεία ανασκόπηση ή προ-ανασκόπηση.

 

Πρωτοκόλλα για μικροσκόπηση ενός SurePath πλακιδίου

  • Η εκπαίδευση θα πρέπει να παρέχεται στους κυτταρολόγους με την αλλαγή από συμβατική κυτταρολογία σε κυτταρολογία υγρής φάσης, οποιαδήποτε και αν είναι η τεχνολογία που χρησιμοποιείται.
  • Το χρησιμοποιούμενο μονιμοποιητικό σε SurePath είναι βασισμένο σε αιθανόλη και παρόμοιο με αυτό που χρησιμοποιείται στη συμβατική κυτταρολογία.
  • Αν και η περιοχή των μικροσκοπούμενων κυττάρων του SurePath είναι μικρότερη από αυτή του ThinPrep, ο χρόνος μικροσκόπησης δεν θα πρέπει να είναι μικρότερος: SurePath τεχνικές δεν είναι μονοεπίπεδες και οι τρισδιάστατες ομάδες κυττάρων χρειάζονται εστίαση με μεγάλη μεγέθυνση σαρώνοντας άνω και κάτω τις κυτταρικές ομάδες.
  • Οι χρήστες του SurePath συνιστούν μία ταχεία μικροσκόπηση της ολότητας του πλακιδίου ακολουθούμενη από μία δεύτερη ενδελεχή μικροσκόπηση με ιδιαίτερη προσοχή στις τρισδιάστατες κυτταρικές ομάδες. (προσωπική ανακοίνωση N. Dudding)
  • Δεν υπάρχουν ειδικές κατευθυντήριες οδηγίες για ταχεία ανασκόπηση ή προ-ανασκόπηση.

 

Εκπαίδευση για κυτταρολογία υγρής φάσης

  • Απαιτείται ειδική εκπαίδευση για κυτταρολόγους με την αλλαγή από συμβατική κυτταρολογία σε κυτταρολογία υγρής φάσης
  • Αν και οι ομοιότητες είναι περισσότερες από τις διαφορές μεταξύ SurePath και ThinPrep, απαιτείται ειδική εκπαίδευση σε καθεμία από αυτές

 

X