Zpracování cytologických vzorků v laboratoři

Zpracování cytologických vzorků zahrnuje příjem vzorku a průvodky přípravy preparátů pro mikroskopické vyšetření, barvení, screening a vytvoření zprávy – nálezu. Všechny tyto procesy podléhají kontrole kvality.

Příjem vzorku a žádanky

  • Jsou kontrolovány preparáty a průvodka, aby se shodovaly
  • Preparáty a průvodka musí mít nejméně tři identifikátory pacientky (jméno, příjmení, datum narození, číslo pojištěnce, nemocnice.
  • Je přiděleno laboratorní přírůstkové číslo.
  • Pacientka je s ním a svým číslem pojištěnce zaregistrována do laboratorního informačního systému (LIS).

 

Příprava preprátů pro mikroskopické vyšetření

  • LBC preparáty jsou vyrobeny dle pokynů a s použitím zařízení výrobce.
  • nejužívanější je systém ThinPrep (Hologic) a SurePath, jejichž manuály by měly být v laboratoři dostupné a dodržovány.
  • Odkazy na ThinPrep zařízení a metodiku jsou na hlavní webové stránce: http://www.thinprep.com/hcp/ifu/
  • Odkazy na BD SurePath http://www1.bd.com/anz/training/surepath

 

Barvení dle Papanicolaoua

  • Regresivní Papanicolaouva metoda je popsána v tabulce 8.xx , jak probíhá v automatických barvicích přístrojích. 
  • Všechny preparáty jsou montovány a označeny.
  • Kvalita barvení jader i cytoplazmy je denně kontrolována

 

Papanicolaouova barvicí metoda

 Po letech experimentů Dr Papanicolaou vyvinul trichromatické barvení, které je dosud užíváno (i když s nevelkou modifikací). Trichromatické barvení kombinuje jedno jaderné barvení - hematoxylin a dvě cytoplazmatické barvy, OG-6 a EA-50. OG-6 barví keratin zatímco EA-50, (dvojité barvení, eosin a azur) barví cytoplazmu dlaždicových buněk, nukleoly a erytrocyty. 

Pro optimální barvení nesmí buňky na skle vyschnout před fixací nebo v průběhu zpracování. To vede k nežádoucím artefaktům. Modifikace barvení jsou časté, protože každá laboratoř preferuje vlastní barevný odstín. Modifikací lze docílit změnou časů barvení hematoxylinem a EA-50.

Jednoduché variace jako obsah chemikálií v tekoucí vodě, provozní teplota, pH vzorku a počet barvených preparátů v lázni mohou ovlivnit barevný výsledek. Je povinností laboratoře udržet kontrolami kvality stabilní výsledek barvení k usnadnění cytologické diagnostiky.

Pokud jsou dobře patrny detaily jaderné struktury a udržena transparentnost cytoplazmy, interlaboratorní variace výsledku barvení jsou akceptovatelné.

 

Progresivní nebo regresivní barvení

Při použití progresivní metody je intenzita jaderného barvení kontrolována ponořením do “modřícího” roztoku poté, kdy bylo jádro obarveno k dosažení žádoucí intenzity hematoxylinu. Modřícím činidlem je nejčastěji Scottova tekoucí voda (pH 8.02). Progresivní barvení barví cytoplazmu velmi slabě.

Při použití regresivní metody je jádro záměrně přebarveno neokyseleným hematoxylinem. Nadbytek barvení je odstraněn zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (kyselou vodou). Odbarvovací proces je zastaven ponořením do tekoucí kohoutkové vody. Kontrola času je zásadní, aby nedošlo k změně hyperchromních jader na hypochromní.

Dalšími proměnnými výsledku barvení dle Papanicolaoua vedle vlastních barvicích postupů i komerční zdroj chemikálií (barev) a pH preparátu. V důsledku toho nelze Papanicolaouovo barvení považovat za stoichiometrické.

Oba popsané postupy fungují a záleží na laboratoři, který zvolí. Výsledek a diagnostická vhodnost jsou srovnatelné. 

 

Charakteristiky Papanicolaouova barvení

Individuální jádra

  • Jasně viditelná malým (objektivem 10x) i velkým (objektivem 40x) zvětšením
  • Modře/purpurově zbarvená
  • Granulární a čistá (nikoli matná)

Dobarvení (cytoplazma)

  • Superficiální dlaždicové buňky - růžové
  • Méně zralé buňky (intermediární a metaplastické) - modré/zelené
  • Plně keratinizované buňky - oranžové.

Barvení má být stejné intenzity

Cytoplazma má být průsvitná a ostře kontrastní proti jádernému barvení. 

Figure 8.8. Ideal Papanicolaou staining

Tabulka 8.1. Regresivní Papanicolaouova barvicí metoda (barvicí automat)

Stanice

Roztok

Čas (minuty)

1

95% Alkohol

1:30

2

70% Alkohol

1:30

3

Hematoxylin

4:00

4

Kyselá voda

0:05

Lázeň 1

Voda

Opláchnout

Lázeň 2

Voda

Opláchnout

Lázeň 3

Voda

Opláchnout

Lázeň 4

Voda

Opláchnout

5

70% Alkohol

2:00

6

95% Alkohol

1:00

7

OG6

2:00

8

95% Alkohol

0:10

9

95% Alkohol

0:10

10

EA50

6:00

11

95% Alkohol

0:15

12

95% Alkohol

0:15

13

Absolutní alkohol

1:00

14

Absolutní alkohol

1:00

15

Absolutní alkohol

1:00

16

Xylén

3:00

17

Xylén

2:00

Výstup

Xylén

1:00

 

Screening a cytologický nález

  • Preparáty screenuje cytotechnolog nebo cytologický screener.
  • Podle místního protokolu jsou všechny preparáty hodnocené jako negativní nebo nedostatečné podrobeny rychlému rescreeningu a každý abnormální se předává vedoucímu cytotechnologovi pro hodnocení.
  • Negativní a inadekvátní výsledky jsou uvolňovány dle lokálního protokolu.
  • Všechny abnormální cytologie se předávají patologovi, případně cytologovi s licencí dle lokálního protokolu pro uvolňování cytologických nálezů.
  • Cytologický nález je podepsán, zaznamenán a odeslán poštou nebo elektronicky k zadavateli vyšetření.
  • Výsledková zpráva zahrnuje doporučení pro ošetření, jako např. doporučení na kolposkopické vyšetření nebo opakování cytologie, pokud je vzorek inadekvátní.
  • HPV testování je indikováno, pokud je třeba ověřit ASC-US/low-grade , nebo jako test vyléčení po ošetření CIN.
  • Pacientka je informována o výsledku testu.
  • Klinik je odpovědný za zajištění odpovídajícího postupu, pokud není platný jiný psaný dokument pro další postup. Měl by být ustaven i kontrolní systém pro zajištění těchto postupů.

Tyto postupy se mohou mezi laboratořemi lišit, ale měly by odpovídat Evropským směrnicím pro zajištění kvality screeningu cervikálního karcinomu (Wiener et al.)

Protokoly pro screening konvenční cytologie a LBC

Manažer laboratoře by měl implementovat ve spolupráci s patologem systém hodnocení a hlášení nálezů

Pro získání zkušenosti by měl screener - cytotechnolog vidět široké spektrum případů. Laboratoř by měla zpracovávat minimálně 15,000 cervikálních nátěrů ročně a každý screener by měl screenovat 50 (konvenčních) nebo 80 (LBC) preparátů denně s přestávkami v pravidelných intervalech. Screener má mít vlastní pracovní stanici a binokulární mikroskop a měl by docílit minimálně 3000 screenovaných preparátů ročně.

Preparáty jsou screenovány objektivem 10x a okulárem 10x, celý preparát týmž. Screener postupuje meandrovitě po celé ploše. Začíná zpravidla v jednom rohu a postupuje krok za krokem, až je prohlédnuta celá plocha.

Obrázek 8.10 Screening konvenčního nátěru

 

Bylo zjištěno, že screener obvykle screenuje 250-300 zorných polí na jednom preparátu (s použitím objektivu 10x). Průměrný čas pro tento postup je u konvenčního nátěru 6-10 minutes (rozsah 5 -20 minut).

Povinností screenera je označit na preparátu buňky důležité pro diagnózu. Pro značení se užívá objektiv 4x. Protokol for značení si rozhodne laboratoř, obvykle je užíván barevný fix pro LBC a bílé tečky inkoustem na konvenčním nátěru. K prohlížení označených buněk se užívá objektiv 20x a 40x.

Screener má předem prostudovat žádanku a screeningovou historii pacientky. 

 

Protokoly pro screening preparátů ThinPrep

  • Při přechodu z konvenčních preparátů na LBC je třeba speciální zácvik cytologů, ať již je užita kterákoli metoda
  • ThinPrep používá fixativum na bázi metanolu, které se liší od etanolových fixativ konvenčního stěru. Jaderný detail je v ThinPrep preprátech dobře zachován, ale jaderná membrána je výraznější a to může ovlivnit rozlišení nezralé dlaždicové metaplazie a HSIL.
  • Screening preparátů ThinPrep lze provádět ze strany na stranu nebo shora dolů, podle toho, co cytolog preferuje.
  • Pro rychlý orientační rychlý prescreening nejsou speciální směrnice. 

Protokoly pro screening preparátů SurePath

  • Při přechodu z konvenčních preparátů na LBC je třeba speciální zácvik cytologů, ať již je užita kterákoli metoda.
  • Fixativum užívané v SurePath je na bázi etanolu a podobné tomu, které se užívá v konvenční cytologii. 
  • Ačkoli plocha buněk pro screenování v SurePath preparátech je menší než v ThinPrep, čas pro screening preprátu by neměl být kratší: preparáty SurePath nejsou monolayery a trojrozměrné formace buněk se musí proostřit ve velkém zvětšení.
  • Uživatelé SurePath doporučují rychlý screening celého preparátu s následným pomalým screeningem cíleným zejména na vrstvené formace. (osobní sdělení N. Duddinga)
  • Pro rychlý orientační screening nejsou speciální směrnice. 

Výcvik v LBC

  • Při přechodu z konvenčních preparátů na LBC je třeba speciální zácvik
  • Ačkoli je více podobností než rozdílů mezi SurePath a ThinPrep , na každý ze systémů se zácvik liší

 

X